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Grani con minore contenuto di peptidi tossici ed immunogenici

by luciano

In evidenza. Il grano duro Levante, tra quelli analizzati, è quello con un minor contenuto di peptidi immunogenici: “Seppure non “sicuro” per i pazienti celiaci, l’utilizzo di questa varietà, ad esempio nelle formulazioni di baby food, potrebbe ridurre l’esposizione durante il periodo più critico per lo sviluppo della malattia (Ivarsson et al., 2002).”

La ricerca “Composition of peptide mixtures derived from simulated gastrointestinal digestion of prolamins from different wheat varieties. Barbara Prandi et al. 2012. Journal of Cereal Science” analizza 24 varietà di grani (tenero e duro) allo scopo di classificarli in funzione della quantità e tipologia di peptidi tossici ed immunogenici. La ricerca sottolinea che “ Seppure non “sicuro” per i pazienti celiaci, l’uso di questa varietà, ad esempio nelle formulazioni di baby food, potrebbe ridurre l’esposizione durante il periodo più critico per lo sviluppo della malattia (Ivarsson et al., 2002)”.

Riassunto
“Il contenuto di gliadina nel grano è molto variabile, sia qualitativamente che quantitativamente, in funzione della genetica della pianta e delle condizioni di crescita. Le gliadine sono tra i maggiori fattori scatenanti della celiachia: i peptidi derivati dalla digestione gastrointestinale di queste proteine e assorbiti dalla lamina propria provocano le reazioni immunologiche che danneggiano la struttura dei villi nei soggetti affetti. Nel presente lavoro, le miscele peptidiche generate dalla digestione gastrointestinale simulata della frazione prolaminica estratta da diverse varietà di frumento (Triticum turgidum subsp. durum e Triticum aestivum) sono state caratterizzate mediante tecniche LC/MS e LC-MS/MS. I peptidi correlati alla quantità di a-gliadina, così come i peptidi tossici e immunogenici per i pazienti celiaci sono stati identificati e quantificati utilizzando uno standard interno marcato isotopicamente. La quantificazione ha dimostrato forti differenze tra le varietà testate. Alcuni campioni, appartenenti alla stessa varietà e/o area di coltivazione, hanno mostrato un contenuto inferiore di α-gliadina, e una minore quantità di peptidi tossici e immunogenici.”

….omissis. Conclusioni

“In diverse varietà di frumento sono stati identificati e quantificati i principali peptidi prodotti dalla digestione gastrointestinale simulata della frazione prolaminica. Diverse varietà di grano hanno portato a risultati variabili in termini di quantità e tipo di peptidi prodotti. Per quanto riguarda i peptidi patogeni correlati alla malattia celiaca, questi dati sono anche di grande interesse dal punto di vista epidemico, in quanto indicano un’elevata variabilità tra i campioni di grano, e questo potrebbe avere un diverso impatto sullo sviluppo della malattia celiaca. Sebbene tutti i campioni di grano siano risultati capaci di generare peptidi patogeni durante la digestione (quindi nessuna varietà può essere considerata “sicura” per i pazienti celiaci), le miscele di peptidi derivate dalla digestione di T. aestivum contengono peptidi meno tossici rispetto a T. durum e T. turanicum, mentre i peptidi immunogenici erano meno abbondanti nei digeriti di T. durum rispetto a T. aestivum e turanicum. Tra i campioni di T. durum, invece, è stata osservata una variabilità piuttosto elevata: D240 era la varietà con il minor contenuto di peptidi tossici, mentre Levante era quella con un minor contenuto di peptidi immunogenici. Seppure non “sicuro” per i pazienti celiaci, l’utilizzo di questa varietà, ad esempio nelle formulazioni di baby food, potrebbe ridurre l’esposizione durante il periodo più critico per lo sviluppo della malattia (Ivarsson et al., 2002).”

Note:
The innate immune response is activated by some sequence of gluten-derived peptides (PSQQ, QQQP, QPYP and QQPY) (Cornell, 1996; De Ritis et al., 1988), that induce the production of interleukin-15 (Londei et al., 2005).

The adaptive immune response, instead, begins with the recognition of some T-cell epitopes in gluten-derived peptides (Ciccocioppo et al., 2005), which are bound by antigen presenting cells that express the human leukocyte antigens DQ2 or DQ8 (Farrell and Kelly, 2002). Moreover, in the lamina propria, the enzyme tissue transglutaminase catalyzes the deamination of specific glutamine residues in the immunogenic peptides (Van de Wal et al., 1998a), causing a stronger immunological response (Molberg et al., 1998). These complexes are recognized by T-cells that induce the intestinal epithelium damages (Nilsen et al., 1998).

Both toxic and immunogenic peptides can reach the lamina propria taking advantage of mucosal defects allowing their passage between or through the epithelial cells (Matysiak-Budnik et al., 2003).

Immunogenic peptides contain one or more epitopes, whose sequence is recognized by HLA-DQ2 or HLA-DQ8 cells: the epitopes found in several identified peptides were PFPQPQLPY (glia-aI), PQPQLPYPQ (glia-aII) (Arentz-Hansen et al., 2000), PYPQPQLPY (glia-aIII) (Arentz-Hansen et al., 2002) and FPQQPQQPF (glia-gII) (Spaenij-Dekking and Koning, 2005). The first two epitopes were contained in a peptide identified as immunodominant after wheat challenge in celiac people in the study of Tye-Din et al. (2010). Interestingly, the immunodominant HLA DQ8-restricted alphagliadin T cell epitope (QGSFQPSQ), proposed to be one of the major triggers of celiac disease (Van de Wal et al., 1998b) was not found in the digested extract, probably because it contains a cleavage site for pepsin and chymotrypsin, that breaks the peptide bond at the C-terminal of phenylalanine.

Parole chieve: grano duro, grano tenero, peptidi tossici; peptidi immunogenici

Gluten is a complex of reserve proteins found in wheat, barley and rye, composed of gliadins (the alcohol soluble fraction) and glutenins (soluble in dilute acids with denaturing agents) (Osborne, 1907). Gluten-derived peptides are formed in the gastrointestinal tract from the incomplete digestion of gluten proteins. As a matter of fact, gluten is not completely digested from gastric, pancreatic and intestinal proteases due to its high content of proline (Stepniak et al., 2006), since the cyclic structure of this amino acid interferes with the enzyme accessibility to the peptidic bond. Thus, from the gastrointestinal digestion of gluten, proteolitically resistant peptides are formed, some of them implicated in the pathogenesis of celiac disease (Shan et al., 2002).

In different wheat varieties, the main peptides produced by simulated gastrointestinal digestion of the prolamin fraction were identified and quantified. Different wheat varieties led to variable outcomes in terms of amount and type of peptides produced. As far as pathogenic peptides related to celiac disease are concerned, these data are also of high interest from the epidemic point of view, since they indicate a high variability among the wheat samples, and this might have a different impact on celiac disease development. Although all wheat samples were found to generate pathogenic peptides upon digestion (thus no variety can be considered “safe” for celiac patients), peptide mixtures derived from the digestion of

T. aestivum samples were found to contain less toxic peptides than

T. durum and T. turanicum, while immunogenic peptides were less abundant in T. durum digests than in T. aestivum and turanicum. Among T. durum samples, on the other hand, a quite high variability was observed: D240 was the variety with the lower content of toxic peptides, while Levante was the one with a lower content of immunogenic peptides. Albeit not “safe” for celiac patients, the use of this variety, for example in the formulations of baby food, could reduce the exposure during the most critical period for the development of the disease (Ivarsson et al., 2002).

As far as cultivation area/farming practices are concerned, the impact is less evident, but somehow present. Given the variety, which is the most important determinant, some areas of cultivation seem to promote a greater content of a-gliadins, toxic and immunogenic peptides in digests, whereas in digested wheat cultivated in other places, less of these peptides seem to be present. Obviously, a more extensive study (in term of varieties and cultivation areas tested) is needed, besides a comparison between different years of cultivation. Moreover, further studies will be needed in order to better define in vivo the role of the identified peptides and to also define the best farming practices which can further lower wheat pathogenicity.

In diverse varietà di frumento sono stati identificati e quantificati i principali peptidi prodotti dalla digestione gastrointestinale simulata della frazione prolaminica. Diverse varietà di grano hanno portato a risultati variabili in termini di quantità e tipo di peptidi prodotti. Per quanto riguarda i peptidi patogeni correlati alla malattia celiaca, questi dati sono anche di grande interesse dal punto di vista epidemico, in quanto indicano un’elevata variabilità tra i campioni di grano, e questo potrebbe avere un diverso impatto sullo sviluppo della malattia celiaca. Sebbene tutti i campioni di grano siano risultati capaci di generare peptidi patogeni durante la digestione (quindi nessuna varietà può essere considerata “sicura” per i pazienti celiaci), le miscele di peptidi derivate dalla digestione di T. aestivum contengono peptidi meno tossici rispetto a T. durum e T. turanicum, mentre i peptidi immunogenici erano meno abbondanti nei digeriti di T. durum rispetto a T. aestivum e turanicum. Tra i campioni di T. durum, invece, è stata osservata una variabilità piuttosto elevata: D240 era la varietà con il minor contenuto di peptidi tossici, mentre Levante era quella con un minor contenuto di peptidi immunogenici. Seppure non “sicuro” per i pazienti celiaci, l’utilizzo di questa varietà, ad esempio nelle formulazioni di baby food, potrebbe ridurre l’esposizione durante il periodo più critico per lo sviluppo della malattia (Ivarsson et al., 2002).

Per quanto riguarda le aree di coltivazione/pratiche di coltivazione, l’impatto è meno evidente, ma in qualche modo presente. Data la varietà, che è il determinante più importante, alcune zone di coltivazione sembrano favorire un maggior contenuto di a-gliadine, peptidi tossici e immunogenici nei digeriti, mentre nei grani coltivati altrove, questi peptidi sembrano essere meno presenti . Ovviamente, uno studio più ampio (in termini di varietà e zone di coltivazione testato) è necessario, oltre che un confronto tra diversi anni di coltivazione. Inoltre, saranno necessari ulteriori studi per definire meglio in vivo il ruolo dei peptidi identificati e per definire anche le migliori pratiche agricole che possono ridurre ulteriormente la patogenicità del grano.

Influenza dei fattori ambientali e genetici sul contenuto tossico ed immunogenico dei peptidi del glutine del grano

by luciano

DomenicoRonga et al. https://doi.org/10.1016/j.eja.2020.126091 Science Direct
Punti salienti
Principali effetti dell’ambiente sull’accumulo di gliadine e peptidi che attivano la celiachia.
• Il fattore genetico contribuisce all’accumulo di peptidi tossici.
• Gliadine e peptidi coinvolti nella celiachia dipendono anche da GDD e precipitazioni.
• La bassa evapotraspirazione diminuisce il livello di gliadine e peptidi coinvolti nella celiachia.
• La selezione per TP (peptidi tossici), IP (peptidi immunogenici), α-GliA2-6, γ-Gli-5 potrebbe essere disancorata da GPC e GV
Abstract
“The impact of environment, genetic selection and their interactions on grain yield of durum wheat genotypes has been extensively studied; however, limited information is available for their influence on gluten quality associated with effects on the amount and composition of glutenins, gliadins and celiac disease (CD)-triggering peptides. In this study, a set of six commonly cultivated durum wheat genotypes were assessed in a multi-environment trial of eight site-year combinations in different Italian regions during two consecutive harvest years (2016 and 2017). While high-molecular-weight glutenin subunits (HMW-GS) were more stable between years, differences in total gluten proteins were mainly due to low-molecular-weight glutenin subunits (LMW-GS) and gliadins accumulation. After mass separation and quantification, two gliadin proteins – γ-Gli-5 and α-GliA2-6 (41.1 and 33.8 kDa, respectively) – were further studied together with toxic (TP) and immunogenic (IP) celiac disease-triggering peptides obtained via simulated gastrointestinal digestion. While TP accumulation was strongly influenced by the genotypes, IP showed marked variation in the different sites with significant genotype-by-year and genotype-by-site interaction. Specific agrometeorological variables (i.e. growing degree days and aridity index) in different growing phases showed a strong negative correlation with α-GliA2-6 and CD-associated peptides. Statistical analysis revealed that the level of gliadins and TP/IP peptides were uncorrelated with grain protein content and yield (resa). The selection of plant materials with good technological properties but with a low content of CD-triggering peptides should combine with ad hoc environment (e.g. site) selection and management practices reducing crop evapotranspiration in the vegetative phase.”
Abbreviazioni
AI aridity index
DtH days to heading

GY grain yield
ET0 total reference evapotranspiration
GDD growing degree days
GPC grain protein content
HMW-GS high-molecular-weight glutenin subunits
IP immunogenic peptides
LMW-GS low-molecular-weight glutenin subunits
RCBD randomized complete block design
SN spikes per unit area
TGW thousand kernel weight
TP toxic peptides
TW test

Keywords
Durum wheat, Gluten protein, Gliadin fraction, immunogenic peptides, Environment effect

Grano duro più tollerabile per soggetti sensibili al glutine non celiaci

by luciano

Lo scopo della ricerca “In search of tetraploid wheat accessions reduced in celiac disease-related gluten epitopes” è l’individuazione di accessioni di grano duro con la minore quantità di frazioni (epitopi) che attivano la risposta avversa del sistema immunitario dell’uomo nella celiachia e non solo.
I grani con una minore quantità di queste frazioni (epitopi) potrebbero aiutare quei soggetti celiaci ancora non diagnosticati (circa il 95% di tutti i pazienti CD): “che consumano quotidianamente proteine del glutine stimolanti la celiachia senza rendersi conto del suo effetto sulla loro salute e benessere”.
I grani individuati pur non essendo idonei per i soggetti celiaci possono “contribuire a ritardare o addirittura prevenire l’insorgenza della celiachia e lo sviluppo dei suoi sintomi in quella parte del popolazione geneticamente suscettibile, specialmente nei bambini (van den Broeck et al.), perché la quantità di epitopi, presenti nei prodotti contenenti glutine consumati è un fattore importante che può influenzare la rappresentazione clinica della celiachia, insieme ad altri fattori riconosciuti come il tipo di latte vaccino, l’omissione dell’allattamento al seno e l’età per l’introduzione del glutine”.
La ricerca ha esaminato il glutine di “103 tetraploid wheat accessions (obtained from the Dutch CGN genebank and from the French INRA collection) including landraces, old, modern, and domesticated accessions of various tetraploid species and subspecies from many geographic origins. Those accessions were typed for their level of T-cell stimulatory epitopes.” La ricerca ha evidenziato l’esistenza di “ 8 CGN and 6 INRA accessions with reduced epitope staining.”
…omissis “Tetraploid wheats contain less T-cell stimulatory a-gliadin epitopes than hexaploid bread wheat because of the absence of the D-genome. The highly immunodominant T-cell stimulating 33-mer is exclusively present in a-gliadins encoded by the D-genome (bread wheat). In addition, the levels of T-cell stimulatory epitopes have been shown to vary among varieties (van den Broeck et al. ). This opens possibilities to select for wheat varieties with significantly reduced a-gliadin epitope levels, aiming at direct use or to apply in breeding programs directed towards large-scale reduction or even total elimination of CD-stimulating gluten-elements from wheat.”

 

Note
Dallo studio:
“A landrace may be a mixture of genotypes, which evolved under the environmental conditions where they were grown because of natural selection and selection by the farmer. Tetraploid wheat can mix up with hexaploid bread wheat very easily under agricultural conditions and care should be taken if the tetraploid wheat should be maintained as a pure genotype. As a result, many commercial lots, currently sold as durum wheat, nearly always contain some hexaploid bread wheat.”

“Differences among wheat varieties in gluten proteins occur because of allelic variation (genotype) that determines the gluten protein composition. The approach we used in this study analyzes this genotypic variation by comparing the same amount of gluten protein per accession. Changes in gluten protein composition have been described, but are mainly expected if growth conditions are extreme (high or low temperature, dry or wet conditions). The varieties and accessions we have analyzed were grown under normal wheat growth conditions and therefore, their influence on the gluten protein composition is not expected.”

“The occurrence of different genotypes and even different ploidy levels in a single genebank accession is a complicating phenomenon for genebank managers to accurately characterize landraces. Many landraces often result from maintenance and selection practices by local farmers directed towards optimizations to local agronomic and food applications. As a consequence, genebank passport data turned out to be poor predictors of the real genetic composition of landrace accessions that may be mixtures of genotypes of tetraploid and even hexaploid wheat species. “

In search of tetraploid wheat accessions reduced in celiac disease-related gluten epitopes. Hetty van den Broeck et al.
www.rsc.org/molecularbiosystems. July 2010 DOI: 10.1039/c0mb00046a

Keywords: grano duro, grano meno tossico, immunogenicità del grano, predisposizione alla celiachia, varietà grano duro più tollerabili, proteine del glutine

Quantificazione del 33-mer presente nell’alfa gliadina del grano

by luciano

Nel grano sono presenti molteplici frazioni in grado di attivare la risposta avversa del sistema immunitario dell’uomo. Tra queste frazioni la più attiva è quella chiamata 33-mer perché è quella più resistente alla digestione umana e perché contiene sei copie dei tre epitopi tossici e i suoi legami intermolecolari sono molto forti.

E’ rilevante conoscere, dunque, la quantità di questa frazione nei grani. Lo studio di cui vengono riportate alcune parti, ha esaminato 57 tipi differenti di grano, antico e moderno, rilevando come sia ampia la differenza della presenza, in tutte le farine di grano tenero e farro spelta, del 33-mer: da 90,9 a 602,6 μg / g di farina. Non è stata, invece, rilevata la sua presenza nel grano monococco e nel grano duro. Questi risultati assumono grande importanza perché consentono di poter scegliere grani con limitata o nulla presenza di questa importante frazione tossica per la realizzazione di prodotti che siano più idonei per le persone sensibili al glutine non celiache o che soffrano di disordini da glutine.

“All gluten protein fractions, namely the alcohol-soluble prolamins and the insoluble glutelins, contain CD-active epitopes3. The prolamin fraction is particularly rich in proline and glutamine and the numerous proline residues lead to a high resistance to complete proteolytic digestion by human gastric, pancreatic, and brushborder enzymes. Studies by Shan et al. (2002) showed that a large 33-mer peptide (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF) from α2-gliadin (position in the amino acid sequence of α2-gliadin: 56–88) is resistant to cleavage by intestinal peptidases4,5. The 33-mer is widely called the most immunodominant gluten peptide4,6,7, because it contains three overlapping T-cell epitopes, namely PFPQPQLPY (DQ2.5-glia-α1a, one copy), PYPQPQLPY (DQ2.5-glia-α1b, two copies) and PQPQLPYPQ (DQ2.5-glia-α2, three copies)3, which result in the initiation of a strong immune response.

Grano Monococco, dicocco e grano duro

by luciano

Grano Monococco, dicocco e grano duro: non hanno la frazione “33mer” considerata la più attiva nell’attivare la risposta avversa del sistema immunitario nei soggetti celiaci. Anche per questo motivo sono i genotipi più adatti per le ricerche che hanno come scopo di “detossificare” le farine o di intervenire con particolari enzimi per idrolizzare i “peptidi tossici” comunque presenti; sono più adatti anche per i soggetti sensibili al glutine NON celiaci.

“Quantitation of the immunodominant 33-mer peptide from α-gliadin in wheat flours by liquid chromatography tandem mass spectrometry.

Kathrin Schalk , Christina Lang , Herbert Wieser , Peter Koehler  & Katharina Anne Scherf. Scientific Reports volume 7, Article number: 45092 (2017).

Abstract

Coeliac disease (CD) is triggered by the ingestion of gluten proteins from wheat, rye, and barley. The 33-mer peptide from α2-gliadin has frequently been described as the most important CD-immunogenic sequence within gluten. However, from more than 890 published amino acid sequences of α-gliadins, only 19 sequences contain the 33-mer. In order to make a precise assessment of the importance of the 33-mer, it is necessary to elucidate which wheat species and cultivars contain the peptide and at which concentrations. This paper presents the development of a stable isotope dilution assay followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry to quantitate the 33-mer in flours of 23 hexaploid modern and 15 old common (bread) wheat as well as two spelt cultivars. All flours contained the 33-mer peptide at levels ranging from 91–603 μg/g flour. In contrast, the 33-mer was absent (<limit of detection) from tetra- and diploid species (durum wheat, emmer, einkorn), most likely because of the absence of the D-genome, which encodes α2-gliadins. Due to the presence of the 33-mer in all common wheat and spelt flours analysed here, the special focus in the literature on this most immunodominant peptide seems to be justified……Omissis…..

Analysis of durum wheat, emmer and einkorn

The 33-mer peptide was also analysed in two durum wheat and two emmer cultivars (genome AABB) as well as two diploid einkorn cultivars (genome AA) (Table 1). In each of these wheat species, the 33-mer was not detected (<LOD). In comparison to hexaploid common wheat, durum wheat, emmer, and einkorn do not contain the D-genome, which originated from hybridisation of T. turgidum dicoccum (genome AABB) with Aegilops tauschii (genome DD)36. The absence of the 33-mer peptide can be explained by the fact that this peptide is encoded by genes located in the Gli-2 locus on chromosome 6D, which is missing in durum wheat, emmer, and einkorn. Studies by Molberg et al. showed clear variations in intestinal T-cell responses between common wheat and tetra- or diploid species due to different degrees of T-cell immunoreactivity between the gluten proteins encoded on the A-, B-, and D-genome. Einkorn cultivars were only recognized by DQ2.5-glia-α1a-specific T-cell clones, but not by DQ2.5-glia-α1b- and DQ2.5-glia-α2-specific T-cell clones. Emmer and durum wheat cultivars were all recognized by DQ2.5-glia-α1a-specific T-cell clones, but only two out of four emmer cultivars and three out of ten durum wheat cultivars activated DQ2.5-glia-α1b- and DQ2.5-glia-α2-specific T-cell clones37. Consistent with our results, Prandi et al.38 found that the 33-mer was not present in durum wheat. As a consequence, this peptide was used as a marker peptide to identify the presence of common wheat in durum wheat flours. One durum wheat cultivar was also analysed by van den Broeck et al.33 and the 33-mer peptide was not detected either”. https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.it